Ajankohtaista

Väitös: Vieraiden proteiinien tuoton parantaminen rihmasienissä (Nykänen)



VÄITÖS ma 18.3.2002 klo 13 Ambiotica, YAA303

FM Marko Nykäsen biotekniikan väitöskirja Protein secretion in Trichoderma
reesei. Expression, secretion and maturation of cellobiohydrolase I,
barley cysteine proteinase and calf chymosin in Rut-C30 (Proteiinien
erittyminen Trichoderma reeseissä. Sellobiohydrolaasi I:n, ohran
kysteiiniproteinaasin sekä vasikan kymosiinin ilmeneminen, erittyminen ja
kypsyminen Rut-C30-mutanttikannassa) tarkastustilaisuus. Vastaväittäjänä
on professori Tuula T. Teeri (Royal Institute of Technology, Tukholma) ja
kustoksena professori Christian Oker-Blom.

Trichoderma-rihmasieni voi erittää omia entsyymejään jopa 35 grammaa
litrassa kasvatusalustaa, mikä ylittää muiden tunnettujen eliöiden
erittämät valkuaisainepitoisuudet. Rihmasienten erittämiä entsyymejä
sovelletaan eloperäisten jätteiden hajotuksessa, elintarvike-,
tekstiili-, kaivos-, pesuaine- sekä puu- ja paperiteollisuudessa.

Marko Nykäsen väitöstutkimuksessa vasta-aineavusteisella mikroskopialla
paikallistettiin siirtogeenisestä Trichodermasta luontaista selluloosaa
hajottavaa entsyymiä sekä vieraita proteiineja kuten ohran entsyymiä ja
vasikan kymosiinia. Luontaiset entsyymit ja kymosiini erittyivät -
vastoin aikaisempaa käsitystä - kauttaaltaan sienirihmastosta eikä
esimerkiksi ohran entsyymin tavoin vain sienirihmaston kärkisoluista.

Aikaisempaa ympäristöystävällisempi teollisuus on mahdollinen entsyymien
ansiosta

Ympäristölle edullisemmat rihmasienten tuottamat entsyymit korvaavat
kemikaaleja teollisuudessa esimerkiksi paperinvalkaisussa. Tehokkaan
proteiinien tuoton ja erityksen lisäksi rihmasienet ovat kilpailukykyisiä
turvallisuutensa sekä taloudellisuutensa ansiosta tuotettaessa suuria
määriä entsyymejä kasvualustaan, josta ne ovat helposti käytettävissä
sovelluksiin.

Eläin- ja kasviperäisiä proteiineja siirtogeeniset rihmasienet erittävät
jopa tuhatkertaisesti vähäisempiä määriä verrattuna sienten omiin
valkuaisaineisiin. Ei yhtään kasviperäistä entsyymiä ja vain muutama
nisäkäsperäinen valkuaisaine on tuotettu rihmasienissä teollisessa
mittakaavassa. Vieraiden eläin- ja kasviperäisten proteiinien pitoisuudet
rihmasienissä voidaan nostaa taloudellisesti merkittäviksi vasta kun on
selvitetty vieraiden proteiinien erityksen ja muokkauksen pullonkaulat
sienisoluissa. Lääketeollisuuteenkin vieraita proteiineja voidaan tuottaa
rihmasienissä vasta kun eritetyt proteiinit olisivat rakenteeltaan ja
aktiivisuudeltaan täysin luontaisten valkuaisaineidensa kaltaisia.

Vieraiden entsyymien erityksen ja prosessoinnin ongelmakohtien löytäminen

Vasikan kymosiinin erittyminen koko sienirihmaston alueelta ei kuitenkaan
riittänyt nostamaan tämän entsyymin tuottomääriä siirtogeenisessä
rihmasienessä, sillä kiinnittymällä sienen soluseinään kymosiini ei
erittynyt kasvuliuokseen yhtä tehokkaasti kuin selluloosaa hajottava
luontainen sellulaasi entsyymi. Sienirihmaston hienorakennetutkimus
osoitti kymosiinin ja sellulaasin käsittävän yhdistelmäproteiinin
erittyvän paremmin soluseinän läpi kuin pelkän kymosiinin.

Tutkimuksessa havaittiin sienisolussa tuotettavan ohran entsyymin - toisin
kuin luontaisen entsyymin ohrassa - kypsyvän puutteellisesti ja
sokeroituvan, mikä esti proteiinin täydellisen aktivoitumisen mutta ei
kuitenkaan sen erittymistä. Saadut tiedot auttavat nostamaan vieraiden
entsyymien tuotantopitoisuuksia rihmasienessä ja tehostamaan niiden
teollista hyödyntämistä. Tulokset ovat merkittäviä myös luontaisessa
isäntäeliössä tehtävän entsyymitutkimuksen kannalta sekä tuotettaessa
lähes mitä tahansa vierasta proteiinia siirtogeenisten mikrobien avulla.

Lisätietoja:

Marko Nykänen, puh. 040 844 0494, mailto:manykane@mappi.helsinki.fi

Tiedottaja Liisa Immonen, puh. (014) 260 1043 tai 050 313 0401 tai
mailto:tiedotus@jyu.fi
josta voi pyytää myös kuvan väittelijästä sähköisenä.

Marko Nykänen, s. Helsingissä, kirjoitti ylioppilaaksi Järvenpään lukiosta
v. 1988 ja valmistui filosofian maisteriksi Jyväskylän yliopistosta
syyskuussa v. 1993 pääaineenaan solubiologia. Suoritettuaan pro gradu
-työnsä Kansanterveyslaitoksen immunobiologian osastolla Helsingissä sekä
molekyylibiologian lopputyönsä Helsingin yliopiston Biotekniikan
instituutissa hän on ollut biotekniikan tutkimus- ja opetustehtävissä
Jyväskylän yliopiston Bio- ja ympäristötieteiden laitoksella v. 1994 –
2000. Tänä aikana hän tehnyt tutkimusvierailuja ulkomailla mm. Macquarien
yliopistoon, Australiaan. Sittemmin hän on toiminut biotekniikan
yrityksessä tutkijana sekä jatkaa rihmasienten proteiinien eritykseen
liittyvää tutkimusta Helsingin yliopistossa.

Protein secretion in Trichoderma reesei. Expression, secretion and
maturation of cellobiohydrolase I, barley cysteine proteinase and calf
chymosin in Rut-C30. Teos on julkaistu sarjassa Jyväskylä Studies in
Biological and Environmental Science numerona 109, 173 s., Jyväskylä 2002,
ISSN: 1456-9701, ISBN: 951-39-1157-8. Sitä saa Jyväskylän yliopiston
kirjaston julkaisuyksiköstä, puh. (014) 260 3487,
mailto:myynti@library.jyu.fi



ABSTRACT

Nykänen, Marko J.
Protein secretion in Trichoderma reesei. Expression, secretion and
maturation of cellobiohydrolase I, barley cysteine proteinase and calf
chymosin in Rut-C30

Secreted amounts of endogenous enzymes, such as cellobiohydrolase I (CBHI)
produced by Trichoderma reesei, are superior to any organism studied so
far. CBHI, the heterologous barley cysteine proteinase (EPB), calf
chymosin and a fusion protein consisting of chymosin joined to the CBHI
core-linker region were produced under the cbh1 promoter in a T. reesei
mutant Rut-C30. The aim was to reveal secretory bottlenecks for the
heterologous proteins.

At the mRNA level, the expression of epb and cbh1 differed clearly.
Transcripts were localised synchronously by in situ hybridisation to the
same compartments as their respective proteins, except that the mRNAs were
absent from the hyphal tips. The 42 kDa heterologous EPB pro-protein was N
-glycosylated and sequentially processed by a postulated Golgi-resident
Kex2p-like peptidase to a secreted polypeptide of 38.5 kDa, and thereafter
to polypeptides of 37.5, 35.5 and 32 kDa exhibiting proteinase activity.
The final 32 kDa EPB was four times less active than the unglycosylated 30
kDa barley EPB. This was shown to result from N-glycosylation which led to
incomplete EPB maturation in Trichoderma.

All the examined heterologous proteins and CBHI were shown to be secreted
into the culture medium and were visualised by immuno microscopy in the
ER, Golgi, secretory vesicles, plasma membrane and also in cell wall but
not in septae. CBHI, chymosin and the chymosin fusion protein occurred
throughout the hyphal length in contrast to EPB which was detected only at
growing apical cells. Immuno-EM morphometry of chymosin and CBHI signals
in the cytoplasm and cell wall was applied to correlate the signals to
volumes of the mature hyphal cell. The total amount of signals in the cell
wall were 4 %, 83 % and 49 % for CBHI, chymosin and for the chymosin
fusion protein, respectively. This result indicates that fusion of the
chymosin to an endogenous carrier prevented the adhesion of chymosin in
the cell wall.


kuuluu seuraaviin kategorioihin: